|
W Pracowni Dozymetrii Biologicznej oznaczamy dawkę pochłoniętą promieniowania jonizującego w organizmie ludzkim przy pomocy różnych metod dozymetrii biologicznej:
-
analizy częstości chromosomów dicentrycznych
-
analizy mikrojąder (ręcznej i semi-automatycznej)
-
analizy translokacji przy pomocy techniki FISH
-
analizy częstości ognisk histonu gamma-H2AX
-
analizy częstości dodatkowych fragmentów acentrycznych przy pomocy przedwczesnej kondensacji chromatyny PCC
Dodatkowo prowadzimy badania genotoskyczności zgodnie z normami OECD 473 i 487 przy pomocy analizy aberracji chromosomowych lub mikrojąder na liniach komórkowych.
Test częstości chromosomów dicentrycznych
Test częstości chromosomów dicentrycznych w limfocytach krwi obwodowej pozwala ocenić dawkę pochłoniętą promieniowania u danej osoby. Limfocyty w pobranej próbce krwi są stymulowane do podziału, hodowane przez 24 godziny, a następnie utrwalone naniesione na szkiełka mikroskopowe. Częstość dicentryków w nienapromienionych, kontrolnych próbkach krwi mieści się w przedziale 1 dicentryk na 1000 – 2000 komórek będących w pierwszej metafazie po podziale. Dicentryki są aberracjami indukowanymi specyficznie przez promieniowanie jonizujące oraz przez niektóre leki cytostatyczne działające podobnie do promieniowania (radiomimetyki).
Dawkę pochłoniętą na całe ciało (otrzymaną w krótkim czasie – acute dose) szacuje się korzystając z krzywej kalibracyjnej dla kobaltu 60 lub promieniowania X (200 kV, 4,5 mA o energii 200 keV) i wyznacza się 95 % przedział ufności dla niej. Używając standardowych metod statystycznych można przeliczyć dawkę otrzymaną w krótkim czasie na dawką chroniczną, jeżeli była otrzymana w czasie kilkudziesięciu godzin oraz oszacować czy mamy do czynienia z dawką podaną na całe ciało, czy tylko na jego część. Wszystkie przeprowadzone obliczenia oparte są na metodach zawartych w normie ISO 19238:2014.
Test mikrojądrowy
Ręczna i semi-automatyczna analiza mikrojąder – pozwala oszacować dawkę pochłonięta w zakresie 0,3 – 3 Gy szybko i precyzyjnie. Popromienne mikrojądra są to fragmenty chromosomów, które nie zostały włączone do jąder komórkowych w czasie podziału i są widoczne jako struktury morfologicznie przypominające jądro w cytoplazmie. Liczba mikrojąder jest proporcjonalne do dawki promieniowania. Test wygląda podobnie do testu chromosomów dicentrycznych – pobieramy niewielką próbkę krwi żylnej. Limfocyty są stymulowane do podziału, dodawana jest cytochalazyna b w celu zablokowania cytokinezy i krew jest hodowana przez 72 godziny. Następnie komórki są utrwalane, nanoszone na szkiełka mikroskopowe, barwione i analizowane ręcznie lub semi-automatycznie (metoda 5- krotnie szybsza a dająca porównywalne wyniki). Dawka odczytywana jest z krzywej kalibracyjnej dla kobaltu 60 lub promieniowania X (200 kV, 4,5 mA o energii 200 keV) i wyznacza się 95 % przedział ufności dla niej.
Analiza translokacji
Analiza translokacji przy pomocy techniki FISH (Fluorescence in situ hybridization) – pozwala oszacować dawkę przy pomocy analizy translokacji. Metoda jest droższa niż analiza dicentryków i używa się jej zasadniczo w dozymetrii retrospektywnej, kiedy od napromienienia do analizy minęło dużo czasu: kilka miesięcy czy lat. W takiej sytuacji częstość chromosomów dicentrycznych spada, natomiast częstość translokacji pozostaje na względnie stałym poziomie.
Analiza translokacji odbywa się na preparatach mikroskopowych uzyskanych podobnie jak przy teście chromosomów dicentrycznych. Utrwalone na szkiełkach mikroskopowych chromosomy hybrydyzowane są ze znakowanymi fluorescencyjnie sondami DNA, dzięki czemu możliwa jest analiza translokacji. W naszym laboratorium barwimy 3 pary chromosomów: chromosomy 1, 2 i 3.
Analiza częstości ognisk histonu gamma-H2AX
Analiza częstości ognisk histonu gamma-H2AX – pozwala oszacować dawkę promieniowania w zakresie 0,1 – 5,0 Gy przy pomocy oceny częstości ognisk histonu gamma-H2AX. Metoda polega na immunohistochemicznym barwieniu ognisk ufosforylowanej wersji histonu H2AX w utrwalonych na szkiełkach mikoskopowych jądrach limfocytów ludzkich. Fosforylacja histonu H2AX zachodzi po uszkodzeniu DNA i jest związana z naprawą podwójnoniciowych pęknięć DNA, które są charakterystyczne dla promieniowania jonizującego.
Analiza częstości dodatkowych fragmentów acentrycznych (PCC)
Analiza częstości dodatkowych fragmentów acentrycznych przy pomocy przedwczesnej kondensacji chromatyny PCC – jest to zbiór metod, gdzie zmiany wywołane promieniowaniem obserwuje się w sztucznie skondensowanym materiale genetycznym w komórkach nie będących w trakcie mitozy. Komórki napromienione wysoką dawką mają trudności aby przejść przez cykl komórkowy i znaleźć się w mitozie, a jest to konieczne jeżeli chcemy zastosować do biodozymetrii metodę analizy częstości dicentryków, analizy mikrojąder (w tym przypadku komórki muszą przejść cały cykl podziałowy i stworzyć jądra potomne) czy analizę translokacji. Metoda przedwczesnej kondensacji chromatyny w zależności od wersji wymaga, aby komórki weszły w fazę G1 albo G2 cyklu komórkowego i jest stosowana przy dużych dawkach promieniowania rzędu kilku Gy, gdy komórki raczej nie dojdą do mitozy.
|
